盐酸克仑特罗（瘦肉精）检测试剂盒 YC-197

本试剂盒采用竞争酶标***法定量测定尿、肌肉，肝脏及饲料中的克伦特罗及其他β兴奋剂。试剂盒中包括了96个试验孔包括标准试验及所有检测用的试剂。如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。

克仑特罗（clenbuterol，CLE）是一种肾上腺受体激动剂即神经兴奋剂，在临床上用于***支气管***、慢性***和肺气肿等疾病，因此药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。其残留量可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、***、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对消费者的健康极有危害。现已被明令禁止用于养殖业。HPLC或GC-MS一直用作检测β兴奋剂的方法，但是其前处理步骤费用昂贵。酶联***检测试剂盒则可经济、快速地检测尿，肌肉，肝脏及饲料中的CLE。

测定原理：

测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对CLE的兔抗体。经过洗涤步骤后，加入CLE酶标记物，标准或样品溶液。CLE与CLE-酶标记物竞争抗体，没有连接的CLE-酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶反应底物（过氧化尿素）和显色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的显色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量，吸收光强度与样品中的CLE浓度成反比。

提供的试剂（2-8℃保存）切勿冷冻

每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下：

1×96孔板（12条×8孔）包被有兔IgG抗体

6×标准液，       (2ml)为分别含0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb 的CLE水溶液

1×CLE过氧化物酶标记物浓缩溶液

1×酶反应底物 （6ml）；含有过氧化尿素

1×显色剂         （6ml）;四甲基联苯胺

1×反应停止液 （7ml）；1M 硫酸

1×PBS        (10ml), 用于稀释CLE-过氧化物酶标记物浓缩溶液

1×PBST浓缩液(40ml)，加800ml蒸馏水稀释，洗板用

样品处理：

样品处理方法1：

组织、肉样（纯精肉）、内脏样品的处理方法:

１．称2克匀浆过的样品加入2 mL溶液１(无色无味)，搅拌或震荡样品，使之混合均匀。

2. 加入6 ml溶液2(淡黄色,具刺激性气味)，推荐用干净的卫生筷或竹签搅拌样品5分钟；或振荡15分钟，使其均匀分布于溶液中。

3．3000g离心10分钟。

4.  取3ml上清液于干净平皿中,60℃恒温箱蒸干(30分钟左右)；也可在试管中直接水浴加热蒸干。

5．残留物用1ml 溶液2 (无色无味) 冲洗溶解。

6．3000g离心10分钟。

7．取清亮中间部分50ul直接加样, ELISA进行分析。

注：如果不慎将溶液弄到皮肤上，请立即用７５％的医用酒精棉花擦拭，并用清水冲洗。切勿饮用及溅入眼睛。

样品处理方法2 （更快速）：

1、称2克匀浆过的样品加入2 mL溶液１(无色无味)，搅拌或震荡样品，使之混合均匀。

2、加入4mL溶液2 (淡黄色,具刺激性气味)，强烈振荡，肉样约2分钟，组织约6分钟。

3、3000g离心5分钟。

4、取1 ml上清液于干净平皿中，70℃~80℃恒温箱蒸干(约需5分钟左右)。或用电吹风，只需3分钟。

5、残留物用0.5 ml 溶液3 (无色无味) 冲洗，将底部白色残留物全部洗入溶液。

6、取洗脱液50ul作检测用。

酶标***分析程序：

1. 测定之前注意事项

a)  使用之前将所有试剂回升至室温20-25℃

b)  使用之后立即将所有试剂放回2-8℃

c)  在使用中不要让微孔干燥

d)  在ELA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELA测定程序中的要点

e)  在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔板

2.酶标记物与微孔板条

a) CLE- 酶标记物 提供的CLE- 酶标记物为浓缩液。由于稀释的酶标记物稳定性不好，所以只稀释实际需用量的酶标记物1：14稀释（1μl酶标液加14μlPBS）。在吸取浓缩液之前，要仔细地振摇，剩余的仍放置2-8℃保存。

b)微孔板条  取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板用胶带封好，放进原袋中重新密封，4℃或-20℃保存，谨防受潮。

3. 标准液    提供的CLE标准液浓度为0, 0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb(ng/ml)

4. 测定程序（室温25℃条件下操作）

a) 剪开铝箔袋，将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。加入20μl的标准液或处理好的样品到各自的微孔中。如果微孔板条一次实验用不完，放回原铝箔袋中封紧，再套一个塑料自封袋夹紧后4℃或-20℃保存，切忌受潮。

b) 加入100μl稀释的酶标记物到微孔底部，25℃孵育30分钟（推荐使用恒温箱）。

c) 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打3次）以***完全除去孔中的液体，用250μl PBST充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次。每次洗板应加入洗液后等2分钟再倒掉。推荐使用洗瓶洗板，这样可加快速度，避免板条间的孵育时间不一致而产生OD值的差异。

d) 反应底物与显色试剂以1：1混合后加入100μl到微孔中，充分混合并在25℃暗处孵育15分钟。

e) 加入50μl反应停止液到微孔中，混合好在450nm 处测量吸光度值，必须在加入停止液后10分钟内读取光度值。

结果：

所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以***个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，因此0标准等于***并且以***比的形式给出吸光度值。

标准的吸光度值（或样品）

----------------------- ×100 =  %吸光度值

0标准的吸光度值

计算的标准值绘成为一个对应CLE浓度（ng/g,或ng/ml）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在0.2-2ng/g(ppb)范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度（ng/g, 或ng/ml）可以从校正曲线上读出。

灵敏度：

克伦特罗测定试剂盒的平均检测下限约为0.1ng/g（0.1ppb）。

特异性：

与克伦特罗类似物的交叉反应：

克伦特罗(Clenbuterol)             ***

溴布特罗(brombuterol)            110%

塞布特罗(cimbuterol )              40%

马喷特罗(mapenterol)              17%

马布特罗(mabuterol)               16%

沙丁胺醇(salbutamol)               9%

妥布特罗(tulobuterol)               2%                  

特布他林(terbutalin)                 2%

莱克多巴胺                             <1%

异丙肾上腺素(Isoproterenol)       <1%

肾上腺素(Adrenalin )                <1%

去甲肾上腺素(Noradrenalin)         <1%

回收率

回收率为90%±15%